해피레포트 - 생화학 실험 - Western Blot 실험 결과

카테고리 : 레포트 > 자연과학계열 파일이름 :생화학 실험 - Western Blo.hwp 문서분량 : 3 page 등록인 : leewk2547 문서뷰어 : 한글뷰어프로그램 등록/수정일 : 15.03.18 / 15.03.18 구매평가 : 다운로드수 : 0 판매가격 : 2,000 원

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보고서설명
-실험 제목 : Western blot -실험날짜 : -실험 목적 : 단백질을 크기별로 분리하는 기술로 항원-항체 반응을 이용하여 전체 단백질에서 특정 단백질만을 Detection 할 수 있다. 이번 Western Blotting은 뉴런으로 분화하기 전인 Neuroblastoma(Ne,신경모세포)를 사용해 신경모세포가 암이 되게 유발하는 단백질을 찾을 수 있다.

본문일부/목차
-실험 방법 1) Sampling (Protein Extraction) ➀ 추출해 낼 세포에 Lysis buffer를 넣고 4도씨에서 원심 분리를 한다. (Lysis buffer는 세포막을 파괴하는 역할을 한다.) ➁ inner membrane과 outer membrane을 준비해 캐스터에 끼운 후 membrane 사이에 증류수를 넣어 물질이 새는지 시간을 두고 관찰한 뒤 새지 않으면 증류수는 버린다. ➂ 50ml 튜브에 폴리아크릴아마이드 3.4ml, TDS와 SDS를 합하여 2.5ml, D.W 4.1ml를 넣고 혼합한 뒤 membrane 사이에 넣어준다. ➃ Lane을 표시할 comb를 넣는다. ➄ Gel을 굳힐 때는 10% AP(Ammonium Persulfate와 TEMED를 사용한다. 2) SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate - poly acrylamid gel elextrophoresis) ➀ E-tube에 각각의 Sample 32㎕, 프루프 버퍼 8㎕ (SDS, Tris)를 넣는다. ->Sample①Ne ②Ne+RA(Retinoic Acid, 분화제) ③NE+Benzo[α]Pypene 0.1ml ④NE+Benzo[α]Pypene 0.3ml ⑤NE+Benzo[α]Pypene 1ml ⑥NE+Benzo[α]Pypene 3ml (SDS와 Tris가 단백질의 이황화 구조를 끊거나 3차 구조를 풀어 실처럼 만들고 모든 아미노산의 전하를 (-)로 바꿔 동일하게 만든다.) ➁ E-tube에 캡을 씌운 후 동동이에 띄워서 100도씨에서 5분간 끓인다. (끓인 후 Sample들은 얼음에 차갑게 보관한다.) ➂ Gel이 굳었는지 확인한 후 comb를 조심스럽게 빼낸다. ➃ membrane(inner membrane을 안쪽에 위치하도록 준비)과 running buffer(Tris+glycine+ 10% SDS)를 전기 영동기에 넣고 준비한다. ➄ lane 2부터 전기영동 기준이 되는 marker를 넣고, lane 3부터 lane 8까지 Sample을 8ul씩 채워넣는다. (이때 pipette tip은 끝이 얇은 로딩 팁을 쓰고 시료를 넣을 때 Gel이 상하지 않도록 주의한다.) ➅ 120V에서 1시간 20분 동안 전기영동을 진행한다. 3) Transfer ➀ 전기영동이 끝나면 membrane을 꺼내 Gel을 membrane으로부터 분리해낸 다음 Gel의 필요 없는 부분은 자르고 Washing한다. ➁ PVDF Transfer paper를 Gel 크기보다 조금 넉넉하게 자른 다음 Paper와 Gel을 Transfer buffer에 적신다. ➂ PVDF Transfer paper의 한쪽 귀퉁이를 잘라 방향을 표시해준다. ➃ 전기를 통하게 해주는 흑연판에 filter paper를 올리고 Transfer buffer로 적신다. 그 위에 PDVF Transfer paper와 Gel을 올린 뒤 다시 filter paper를 올리고 Transfer buffer로 적신다. 흑연판을 덮어 전기를 연결한다.

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