해피레포트 - [생화학실험] RNA polymerase 분리 정제

카테고리 : 레포트 > 사회과학계열 파일이름 :[생화학실험] RNA polymera.hwp 문서분량 : 4 page 등록인 : leewk2547 문서뷰어 : 한글뷰어프로그램 등록/수정일 : 12.05.24 / 12.05.24 구매평가 : 다운로드수 : 0 판매가격 : 1,200 원

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보고서설명
① pellet을 녹인 후 Buffer LB 26ml 분주하여 섞는다. ② 잘 섞은 pellet을 ice에 박혀있는 비커에 붓고 stirring하여 6ml lysozyme에 분주한 다음, 66ml PMSF와 33ul leupeptin도 첨가한다. (20min 반응시간 준다.) ③ 20min 후, 3ml 0.8% Sodium deoxycloate 첨가하고 20min 반응 시간 준다. ④ 20min 후, 50ul PMSF 첨가하고 5.6ml 2M Ammonium Sulfate 첨가한다. ⑤ Total volume 56ml 까지 Buffer LB를 첨가한다. ⑥ 5.6ml 10% PEI를 아주 천천히 넣어주고 20 min 반응시간 준다. ⑦ 39.00g 4도에서 15min ultra centrifuge한다. ⑧ supernatant만 비커에 담고 전체 volume의 0.82배(46ml) ammonium sulfate를 천천히 첨가시켜 15min 반응시킨다.

본문일부/목차
④ Ammonium sulfate 고농도의 염 용액 속에서는 Protein은 뭉쳐서 침전하는 경향이 있다. 이러한 기술을 Salting Out(Salting out effect - Protein은 구조상 hydrophobic한 부분은 분자의 내부에 위치하고 hydrophilic한 부분은 분자의 밖에 위치하여 물과 결합되어 안정을 유지한다. 여기서 Ammonium Sulfate는 염의 종류로 침출 효과, pH의 다양성, 고도의 용해성, 용액의 저열, 저가 등과 같은 많은 유용한 특성들과 연관되어 있다. ⑤ PEI PEI는 많은 branch ed orgarnic polymer를 가지고 있다. 각 branch마다 질소 원자가 포함되어 있어 상당히 높은 양전하를 띄게 되는데, 이렇게 높은 질소 원자의 분포는 다양한 구조를 가지지게 되고 또한 완충 작용을 해주므로 다양한 pH에서 안정적이다. ⑥ Sephadex 세균 Leucostoc nesebteriodes 가설탕에서 합성하는 덱스트란(분지하는 D-포도당 중합체로 주사슬은 α1→6결합, 분기점은 α1→3결합으로 구성된다)을 에피클로로히드린으로 가교하여 비즈모양으로 성형한 친수성겔. 화학적으로 안정하며, 흡착이 적고 저압에서의 겔여과에 최적인 겔로서 널리 사용하고 있다. G-10부터 G-200까지 가교도의 차이에 따라 여러 가지 종류가 있다. 이들 분획범위는 전체적으로 펩티드, 단백질에 대해 분자량이 수백에서60만에 이른다. 자란 cell을 통해 원하는 T7 RNA polymerase가 생겼는지 확인하기 위하여 먼저 cell lysis를 한다. Buffer LB(EDTA 포함)와 lysozyme, PMSF, leupeptin을 첨가하면 EDTA가 세포벽의 integrity를 유지하는 데 필수적인 calcium ion을 제거하여 세포벽이 군데군데 무너지게 한다. 이 때, 세포의 형태를 유지하기 위하여 lysozyme도 함께 넣어주고, 단백질이 분해되지 않도록 PMSF와 leupeptin도 넣어준다. DTT는 DNA를 석출시키는데 사용되며 더 완벽한 용해를 위하여 sodium deoxycholate을 첨가한 뒤 centrifuge하면 원하는 단백질이 supernatant에 녹아 있게 된다.

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